Das Funktionsprinzip eines Flugzeitdetektors ist sehr einfach: Die Ionen werden an einem Startpunkt durch Anlegen einer Beschleunigungsspannung in des Flugrohr beschleunigt, sie haben dann alle die gleiche kinetische Energie. Innerhalb des Flugrohrs erfahren die Ionen keinerlei Kräfte, sie bewegen sich durch einen feldfreien Raum (d.h., es gibt hier weder elektrische noch magnetische Felder, durch die Ionen beeinflusst werden würden). Die Ionen werden hier aufgrund ihres m/z-Wertes voneinander getrennt, da Ionen höherer Masse diesen Bereich langsamer durchqueren als leichte Ionen (gleiche kinetische Energie 1/2mv^2, dadurch abhängig von der Masse unterschiedliche Geschwindigkeit). Am Ende des Flugrohrs treffen die Ionen auf den Detektor. Der m/z-Wert wird aus der ermittelten Flugzeit und der Beschleunigungsenergie ermittelt.
Die meisten Flugzeitmassenspektrometer können in zwei Modi betrieben werden: Linearer Messmodus und Reflektormodus.
Im Linearen Messmodus wird (wie oben beschrieben) das Flugrohr nur einmal durchquert. Dadurch ist die Detektion sehr sensitiv, da auch ungeladene Fragmente, die während des Weges durch das Flugrohr aus den korrekt beschleunigten Ionen entstehen, am Detektor ein Signal erzeugen. Da diese Fragmente aber eine geringfügig andere Geschwindigkeit als ihre Vorläuferionen haben können, ist die Auflösung im Linearmodus limitiert.
Im Reflektormodus werden die Ionen durch Anlegen einer Spannung an einem sogenannten Reflektor (auch Ionenspiegel genannt) reflektiert und durchlaufen das Flugrohr ein zweites Mal. Durch die längere Flugzeit wird eine höhere Auflösung erzielt. Zudem ermöglich der Reflektor einen Ausgleich von geringen Geschwindigkeitsunterschieden von Ionen mit gleichem m/z-Wert, wodurch die Auflösung zusätzlich erhöht wird. Da im Reflektor allerdings nur Ionen umgelenkt werden, ist der Reflektormodus nicht so sensitiv wie der Lineare Messmodus. Da die Auflösung eines Flugzeitmassenspektrometers u.a. von der Flugstrecke abhängt, kann der Ionenstrahl auch mehr als einmal reflektiert werden. Dies geht allerdings auf Kosten der Sensitivität, da der Ionenstrahl durch Stöße mit Restgas seine Fokussierung schrittweise verliert.
Der Lineare Messmodus wird daher vorrangig für die Analyse von Makromolekülen, z.B. Proteinen, genutzt, während mit dem Reflektormodus kleine Moleküle und Peptide analysiert werden.
Bei den Flugzeitmassenspektrometern unterscheidet man zudem die Art der Anordnung des Flugrohrs zum Ionenstrahl. Bei den meisten MALDI-Massenspektrometern ist das Flugrohr parallel zum Ionenstrahl angeordnet. Bei ESI-Massenspektrometern ist die orthogonale Anordnung des Flugrohrs zum Ionenstrahl gebräuchlicher (oa-TOF – „orthogonal acceleration“). Dadurch ist auch der Detektor beim oa-TOF nicht innerhalb der Flugbahn des ursprünglichen Ionenstrahls, was Artefakte verhindert. Die unterschiedliche Anordnung des Flugrohrs ist notwendig, da bei den ESI-Massenspektrometern ein kontinuierlicher Ionenstrahl erzeugt wird, von dem dann im oa-TOF nur ein Ausschnitt beschleunigt wird, bei MALDI-Massenspektrometern durch den Laserpuls Ionenpakete erzeugt werden, die vollständig im TOF-Analysator analysiert werden können.