teutolab-biotechnologie
erster Abschnitt - Kettenabbruch-Synthese
Ziel dieses ersten Schrittes ist die Synthese komplementärer Stränge unterschiedlicher Länge. Um dieses Ziel zu erreichen, führt man eine veränderte PCR durch, welche sich das Prinzip des Kettenabbruchs zu Nutze macht. Wie bei der PCR verwendet man auch hier eine ursprüngliche Probe, in diesem Fall unsere zu sequenzierende DNA, sowie Taq-Polymerase und Primer. Es wird allerdings nur eine Primersorte verwendet, da nur einer der DNA-Doppelstränge als Matrize dienen soll. Ebenso wie bei einer normalen PCR werden auch freie Nukleotide, die Desoxyribonukleosidtriphosphate (dNTP´s) der vier Basen eingesetzt. Neben diesen "normalen" freien Nukleotiden werden außerdem in geringerer Menge markierte Abbruchnukleotide, die Didesoxyribonukleosidtriphosphate (dNTP´s) der vier Basen verwendet.
Wie bei einer PCR binden nach der Hybridisierung des Primers die freien Nukleotide komplementär an den Matrizenstrang und werden von der Taq-Polymerase verknüpft. Dabei werden (dNTP´s und (ddNTP´s gleichermaßen nach dem Zufallsprinzip eingebaut. Da nach dem Einbau eines einzigen (ddNTP´s allerdings ein Abbruch der Synthese erfolgt, entstehen zufällig verschieden lange Syntheseprodukte, wobei jede dieser neuen Kopien endständig ein (ddNTP samt Fluoreszenzfarbstoff aufweist. Jede erdenkliche Länge eines bis zu 1000 Basenpaare großen DNA-Abschnittes ist mehrmals vertreten. Somit sind jeder einzelnen Base der ursprünglichen DNA mehrere verkürzte komplementäre Fragmente der entsprechenden Länge samt komplementärem Abbruchnukleotid und Fluoreszenzfarbstoff zugeordnet. Mit den so erhaltenen Produkten wird im zweiten Schritt, der Kapillarelektrophorese, weitergearbeitet.
Kapillarelektrophorese
Die Kapillarelektrophorese trennt DNA-Fragmente unterschiedlicher Länge über Kapillaren auf (ähnlich wie die Gelelektrophorese solche Fragmente über ein Gel auftrennt). Dabei wird die DNA durch eine sehr dünne Kapillare geleitet, welche gerade einmal 10 Nanoliter (10-6 ml) fassen kann. Der Antrieb der Bewegung erfolgt wie bei der Gelelektrophorese über ein elektrisches Feld, in welchem die negativ geladene DNA Richtung Anode wandert. Kleinere DNA-Fragmente wandern schneller durch die Kapillaren als größere.
Die verschieden langen Fragmente lagern sich hintereinander an und erreichen nach und nach das Ende der Kapillare. An diesem Ende ist ein Laser installiert, welcher die an die Abbruchnukleotide gekoppelten Farbstoffe zur Fluoreszenz anregt, sodass ein Detektor die entsprechende Farbe aufnehmen kann. Da jedes Fragment nur ein einziges ddNTP verbaut hat, leuchtet jedes Fragment nur in der Farbe der entsprechenden Base des ddNTP´s. Jede detektierte Farbe wird wie ein Strichcode von einem Computerprogramm abgespeichert und in die entsprechende Base umgeschrieben, für welche die jeweilige Farbe steht. Da die so erhaltene Basensequenz den neu synthetisierten Strang beschreibt, müssen die Basen abschließend noch in die komplementäre Sequenz übersetzt werden.
dNTP´s
Bei den bei einer normalen PCR verwendeten freien Nukleotiden handelt es sich um dNTP´s, also Desoxyribonukleosidtriphosphate. "Desoxyribo-" steht für den verbauten Zucker, die Desoxyribose, während die Bezeichnung "Desoxyribonukleosid-" die Einheit aus einem Desoxyribose-Molekül mit einer der vier Basen bezeichnet. Das angehängte "-triphosphat" steht für drei Phosphatgruppen. Die gesamte Einheit von Zucker, Base und Phosphatgruppen nennt sich allgemein Nukleotid.
Im Rückgrat der DNA wechseln sich Desoxyribose und Phosphat wie eine Perlenkette ab. Folglich müssen beim Einbau eines dNTP´s von einer Polymerase zwei Phosphatgruppen abgespalten werden. Die bei der Abspaltung dieser beiden Phosphatgruppen freiwerdende Energie wird verwendet, um die einzelnen Nukleotide chemisch miteinander zu verbinden.
ddNTP´s
Die markierten Abbruchnukleotide (ddNTP´s) sind modifizierte dNTP´s und chemisch in zweierlei Hinsicht verändert:
Zum einen ist in ihnen der Zucker Didesoxyribose anstelle der natürlichen Desoxyribose verbaut. Durch diese chemische Modifikation wird eine der Bindungsstellen blockiert, über welche sich normalerweise das Desoxyribose-Phosphat-Rückgrat der DNA verknüpfen würde. Da eine weitere Verknüpfung verhindert wird, hat dies zur Folge, dass die Taq-Polymerase an ein ddNTP kein weiteres dNTP oder ddNTP mehr anhängen kann.
Zum anderen sind die ddNTP´s chemisch durch einen Fluoreszenzfarbstoff markiert. Jedem ddNTP-Molekül der vier verschiedenen Basen (also ddATP, ddGTP, ddCTP und ddTTP) ist eine von vier verschiedenen Farben der Fluoreszenzfarbstoffe zugeordnet (meist blau, grün, gelb und rot).