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Restriktionenzyme

Restriktionsenzyme sind Endonukleasen bakteriellen Ursprungs. Sie schützen den eigenen Organismus vor dem Eindringen von Fremd-DNA, indem sie diese durch Spaltung der Phosphodiesterbindungen an einer bestimmten Erkennungssequenz zerkleinern. Die eigene DNA wird dabei durch Anhängen von Methylgruppen an die fraglichen Sequenzen geschützt.

Man unterscheidet drei Typen von Restriktionsendonukleasen (I, II und III). Für die Anwendung in der Bioanalytik sind ausschließlich die Restriktionsenzyme des Typs II von Interesse: Sie schneiden innerhalb oder nahe an der Erkennungssequenz, haben keinen ATP-Bedarf und die Erkennungssequenzen umfassen 4-8 Basen. Von besonderer Bedeutung ist hier wiederum der Subtyp P. Hier sind die Erkennungsstellen palindromisch bzw. symmetrisch, d. h. die Abfolge auf dem Matrizenstrang kann auf dem komplementären Strang rückwärts gelesen werden (z. B. CCATGG/GGTACC). Restriktionsenzyme können die beiden komplementären Stränge glatt durchschneiden, so dass bei den Fragmenten stumpfe Enden (‚blunt ends‘) entstehen. Meist produzieren sie jedoch durch versetztes Schneiden überhängende Einzelstränge (‚sticky ends‘).

Die Benennung von Restriktionsenzymen orientiert sich an deren Ursprungsorganismen: Der erste Buchstabe steht für deren Gattung, die nächsten zwei Buchstaben für den Artnamen. Es folgt eine römische Zahl für die Reihenfolge der Entdeckung.

Im Folgenden sind einige typische Restriktionsenzyme und ihre Erkennungssequenzen aufgeführt.

Ein Restriktionsenzym benötigt ebenso wie andere Enzyme optimale Reaktionsbedingungen, um bestmöglich funktionieren zu können. Für den ‚Restriktionsverdau‘ werden eine ausreichende Menge an Substrat (in diesem Fall DNA), die geeignete Inkubationstemperatur und -zeit, sowie ein geeigneter Reaktionspuffer benötigt. Ein Puffer ist eine Lösung, die die geeigneten Reaktionsbedingungen wie pH-Wert und Ionengehalt etc. einstellt. Im Restriktionspuffer sind Tris(hydroxymethyl)-aminomethan (TRIS) zur Stabilisierung des ph-Wertes sowie MgCl2 und NaCl enthalten.

Restriktionsfragmentanalyse

Nach der Spaltung der DNA durch das Restriktionsenzym können bei verschiedenen Organismen unterschiedlich viele DNA-Fragmente mit einer unterschiedlichen Anzahl an Basenpaaren entstehen. Diese Fragmente können dann mittels der Gelelektrophorese aufgetrennt werden. Die so entstehenden DNA-Banden können gezählt werden, die Größe der DNA-Fragmente kann durch den auf das Gel aufgetragenen Längenstandard bestimmt werden. Vergleicht man das Bandenmuster einer zu untersuchenden Probe mit Proben, die sicher von bestimmten Arten stammen (Referenzen), so können daraus Rückschlüsse auf die entsprechenden Arten gezogen werden.